1.4. 酶类¶

新陈代谢是生命活动基础，亦是最重要特征；复杂的物质、能量变化均在酶催化下进行。

1.4.1. 通论¶

酶为生物催化剂，与一般催化剂类似能改变反应速率，但不改变反应平衡常数。

酶的特点：

易失活（需温和反应条件）

高催化效率（转换数：一定条件下每秒每酶分子转换底物数或每秒每μM酶分子转换底物μM数；衡量酶催化效率）

高度专一性（对底物、反应具严格选择；常只催化一种或一类反应）

受调节控制（浓度：诱导/抑制合成、调节降解；激素；反馈抑制：催化物质生成的首酶常被终产物抑制；抑制剂、激活剂；别构调控、酶原激活、可逆共价修饰等）

1.4.1.1. 化学本质及组成¶

酶除具催化活性的RNA外均为蛋白质；催化活性依赖空间结构。

单纯蛋白质：仅含蛋白质成分。

缀合蛋白质（全酶）：除含蛋白质（脱辅酶）外，还结合热稳定成分（辅因子：金属离子、非蛋白小分子）。

辅因子：依结合形式分辅酶（与脱辅酶结合松弛，可透析去除）、辅基（以共价键与脱辅酶结合）。

酶对辅酶/辅基具一定选择性。

酶蛋白分子依据蛋白分子性质可分：

单体酶（常由一条肽链组成，少数由多条肽链组成；多为水解酶）、

寡聚酶（由两个或以上亚基构成的酶）、

多酶复合体（由多种酶靠非共价键嵌合成，利于系列反应连续进行；脂肪酸合酶复合体、丙酮酸脱氢酶复合体）。

1.4.1.2. 命名及分类¶

习惯命名法：

依据底物命名（蛋白酶、淀粉酶等）；

依据催化反应命名（水解酶、转移酶等）。

系统命名法：以酶催化整体反应为基础，标示底物及催化反应性质。

酶分6大类：

氧化还原酶类（催化氧化还原反应；氧化酶、脱氢酶）、

转移酶类（催化基团转移，将A分子某基团转移至B分子）、

水解酶类（催化水解反应）、

裂合酶类（催化底物移去某基团而形成双键或其逆反应）、

异构酶类（催化各同分异构体间相互转变；分子内基团重排）、

连接酶类（催化有ATP参与的合成反应）。

1.4.1.3. 专一性¶

结构专一性：只作用一种底物，而不作用其它任何物质（绝对专一性）。相对专一性：作用一类结构相近的底物（基团专一性、键专一性）。
立体异构专一性：当底物具立体异构时，仅作用其中一种；旋光异构专一性、几何异构专一性。
酶作用专一性假说：诱导契合假说，酶分子、底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，构象变为利于底物结合，酶与底物进而互补契合进行反应。

1.4.1.4. 分离纯化及测定¶

酶活力（酶活性）：酶催化某一反应的能力，一定条件下所催化的某反应速率。

酶活力单位（U）：一定条件下，一定时间内将定量底物转化为产物所需酶量。

Kat单位：最适条件下每秒催化1M底物转化为产物的酶量。1Kat=60×106IU。

比活力：代表酶纯度，每mg蛋白所含酶活力单位数；越高则纯度越高。

测定：

分光光度法（底物、产物的光吸收不同）；
荧光法（底物、产物的荧光性质）；
同位素法；
电化学法（pH测定法：维持恒定pH而耗酸碱的速率表示，多用于脂酶活力测定）。

酶提纯方法评价：总活力的回收，比活力的提高倍数。

\(总活力=活力单位数/ml酶液 * 总体积（ml）\)；

\(比活力=\frac{活力单位数}{mg蛋白}=\frac{总活力单位数}{总蛋白mg}\)；

\(纯化倍数=\frac{每次比活力}{首次比活力}\)；

\(回收产率=\frac{每次总活力}{首次总活力}\)。

1.4.1.5. 核酶、抗体酶、同工酶¶

核酶：具催化活性的RNA；分子内反应（自我剪接：Ⅰ、Ⅱ类；自我剪切），分子间反应。
抗体酶：具催化能力的蛋白质，本质为免疫球蛋白，在其可变区具酶活性。
同工酶：催化相同反应，但蛋白分子结构、理化性质、免疫性能存在明显差异的一组酶；可作遗传标志，与发育、组织分化密切相关，代谢调节，癌基因表达。

1.4.1.6. 酶工程¶

酶工程：研究酶生产、纯化、固定技术、就够修饰、改造及其应用。天然酶具不稳定性，分离纯化难、成本高。
化学酶工程：初级酶工程；对天然酶、化学修饰酶（功能基修饰、交联、大分子修饰）、固定化酶（吸附、包埋、共价偶联、交联；提高酸碱、温度稳定性，增加使用寿命、简化工艺）、人工模拟酶（为非蛋白有机物，具空间构象、催化基团）的研究应用。
生物酶工程：高级酶工程；克隆酶、突变酶（修饰基因）、新酶（新基因产生）

1.4.2. 酶促反应动力学¶

酶促反应动力学：研究酶促反应速率、影响速率因素的科学；研究酶结构与功能关系、作用机制，寻找最佳反应条件等。
反应速率：单位时间内反应物/生成物浓度的改变；测定实质为不同时间处反应物/生成物浓度的测定。
反应分子数：反应中真正相互作用的分子数。反应级数：反应速率服从某类分子反应速率，即为对应级数反应；实际等于反应速率方程中各反应物浓度指数之和；反应速率与反应物浓度无关的反应为零级反应。
一级反应：反应速率只与反应物浓度一次方成正比。
- \(C=c_0e^{-kt}\)；
- 当t=t1/2时，\(c=\frac{1}{2}c_0\)；
- 即不论反应物初浓度，半衰期均一致，为一级反应特征。
二级反应：反应速率与反应物浓度二次方成正比。
- 假设反应物初浓度一致，\(k=\frac{1}{t} * \frac{x}{a(a-x)}\)；
- 当x=1/2a时为半衰期，\(t_{\frac{1}{2}}=\frac{1}{ka}\)；
- 即二级反应半衰期与初浓度成反比，浓度愈大，半衰期愈短；为二级反应特征。
零级反应：反应速率与反应物浓度无关，而受其它因素影响。
- x=kt；\(t_{\frac{1}{2}}=\frac{a}{2k}\)；
- 即半衰期与初浓度成正比，浓度愈大，半衰期愈长。

1.4.2.1. 底物浓度对速率影响¶

中间复合物学说：酶催化反应时，先与底物结合形成中间复合物，再生成产物，释放酶。
米氏方程：\(ν=\frac{V_{max}+[S]}{K_m+[S]}\)；Km：米氏常数，只与酶性质相关，为酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度（mol/L）。
- 当[S]≪Km时，v与[S]从正比；
- 当Km≪[S]时，v=Vmax，只此可用于测定酶活力；
- 当[S]=Km时，v=1/2Vmax。
- 意义：Km为酶特征常数；可判定酶专一性、天然底物（Km最小的底物称最适底物；\(\frac{1}{K_m}\) 可近似为酶对底物亲和力）；推断反应方向、途径。
多底物反应：序列反应（底物结合、产物释放具一定顺序，产物再底物完全结合前不被释放；有序反应、随机反应）；乒乓反应（酶依次与底物反应）。

1.4.2.2. 抑制作用¶

失活作用：使酶蛋白变性而酶活力丧失。抑制作用：酶的必需基团化学性质改变，但酶未变性而引起酶活力降低活丧失。引起酶抑制作用的物质称抑制剂，对酶抑制作用具选择性。
抑制类型：
- 不可逆抑制作用（酶的修饰抑制；抑制剂与酶必需基团以共价键结合；不能经透析、超滤等物理方法去除恢复活性）；
- 可逆抑制作用（抑制剂与酶以非共价键结合使酶活力降低活丧失，可经物理方法去除恢复活性；
  竞争性抑制：抑制剂与底物竞争酶结合部位；
  
  非竞争性抑制：底物与抑制剂同时和酶结合于不同部位；
  
  反竞争性抑制剂：酶只与底物结合后才可与抑制剂结合）。
- 经测定不同酶浓度下反应初速率，以初速率-酶浓度作图；在无抑制剂时为过原点直线；加入不可逆抑制剂时直线右移；加入可逆抑制剂时斜率降低。

表 1.4.1 不同可逆抑制的米氏方程及常数¶
类型	米氏方程	Vmax	Km
无抑制	\(ν=\frac{V_{max}+[S]}{K_m+[S]}\)	Vmax	Km
竞争性	\(ν=\frac{V_{max}+[S]}{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})+[S]}\)	不变	增加
非竞争性	\(ν=\frac{V_{max}+[S]}{(K_m+[S])(1+\frac{[I]}{K_i})}\)	减小	不变
反竞争性	\(ν=\frac{V_{max}+[S]}{K_m+(1+\frac{[I]}{K_i})[S]}\)	减小	减小

抑制剂：
- 不可逆抑制剂：
  非专一性：有机磷化物与Ser羟基结合，有机汞、有机砷与Cys巯基作用抑制含巯基酶，重金属盐，烷化剂，氰化物、硫化物、CO，青霉素；
  
  专一性：
  
  Ks型，通过酶亲和力修饰酶，亲和标记试剂；
  
  Kcat型，酶催化后作用于必需基团、辅基；
- 可逆抑制剂（常为竞争性抑制剂）。

1.4.2.3. 其它因素影响¶

温度，酶在较低温度范围时酶反应速率随温度升高增大，超过某一温度后下降；反应速率最大时的温度称最适温度。固态酶比溶液中的具高温度耐受性。

pH，酶活力在某以pH下时为最大；称此pH为最适pH。

影响因素：过酸、碱可使酶空间结构破坏，改变构象，丧失活性；pH改变不明显时酶活力易受影响，pH影响底物解离状态、活性部位基团解离、中间复合物解离状态等；影响维持酶空间结构的基团解离。

激活剂，提高酶活性的物质；对酶作用具选择性。K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺（激酶、合成酶）、Zn²⁺、Fe²⁺、Cl^-（唾液淀粉酶）、Br^-、I^-、CN^-、PO₄^3-等，某些小分子有机物：Cys、GSH等。

1.4.3. 作用机制及调节¶

酶活性部位：酶催化能力仅限于一定区域，少数氨基酸参与底物结合、催化，这些氨基酸残基在空间上相对集中；

分结合部位（底物结合，决定专一性）、催化部位（催化断键、成键，决定催化能力）。

活性部位仅占酶分子总体的一小部分；为三维实体；活性部位并不与底物现状完全互补，结合时经诱导契合；处于酶分子表面裂缝内；底物经次级键结合；具柔性、可运动性。

活性部位研究：侧链基团化学修饰（非特异共价修饰、特异共价修饰、亲和标记）；动力学参数测定；X射线晶体结构分析；定点诱变。

反应特性：类型为仅涉及电子转移的或涉及电子及质子或其它基团转移；催化作用由氨基酸侧链功能基团、辅酶为媒介；最适pH常狭小；稳定活性部位构象的巨大酶结构；活性部位具多催化基团协同催化、定向效应、底物产生的键张力利于过渡态复合物形成。

1.4.3.1. 影响催化效率因素¶

邻近效应：酶与底物结合形成中间复合物后，使底物间、催化基团与底物间结合于同一分子而使有效浓度升高，增加反应速率。
定向效应：底物反应基团间、酶催化基团与底物反应基团间正确取向产生的效应。
酸碱催化：通过瞬时向反应物提供、接受质子以稳定过渡态，加速反应；影响因素：酸碱强度、质子传递速率。
共价催化：催化时，亲核催化剂、亲电子催化剂可分别放出、汲取电子并作用于底物缺电子中心负电中心，迅速形成不稳定共价中间物，降低活化能，加速反应。
金属离子催化：金属酶、金属-激活酶；通过结合底物定向反应、可逆改变金属离子氧化态调节氧化还原反应、静电稳定及屏蔽电荷。
多元催化及协同效应（多因素结合作用）；活性部位微环境影响。

1.4.3.2. 活性调节¶

别构调节：酶非催化部位与别构剂可逆非共价结合而使得构象改变，改变酶活性状态。

别构剂：效应物，导致酶活性增加的为正效应物，反之负效应物。异促效应：非底物分子调节物对别构酶的调节作用。

别构酶：多为寡聚酶，经次级键由多亚基构成；经加热、化学处理引起酶解离失去调节活性，称脱敏作用；动力学不符米氏方程，正协同（S形曲线）、负协同（表观双曲线）， \(Rs=81^{\frac{1}{n}}\) （正协同n>1，负协同n<1）；K型效应物：改变底物 \(K_{\frac{1}{2}}\) 不改变 \(V_{max}\) ，V型效应物：改变底物 \(V_{max}\) 不改变 \(K_{\frac{1}{2}}\) 。

别构模型：协同模型：齐变模型，调节物结合时，当某亚基从T态变为R态时，其它亚基同时变为R态；不适于负协同效应。续编模型：酶构象改变以序变方式进行，配体与亚基结合仅引起该亚基构象变化，但可使邻近亚基易于与配体结合。

酶原激活：不具活性的蛋白质前体，经水解作用构象变化形成活性部位，而具有生物活性；消化酶、某些激素、胶原等。

可逆共价修饰：共价调节酶对多肽链某些基团进行可逆共价修饰，使酶处于活性、非活性的互变态，调节酶活性；磷酸化等。